抗疏水配体结合蛋白多肽抗体在干燥综合征诊断中的意义
发表者：周明宣 何菁等
日期：2015-05-07
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【摘要】 目的应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测患者血清中抗疏水配体结合蛋白(1ipocalir，，LcN)多肽抗体，了解该抗体在干燥综合征(ss)诊断中的意义。方法以固相法合成的LcN蛋白多肽为包被抗原，应用EIJlsA法分别检测85例ss(包括72例原发性ss和13例继发性ss)、56例系统性红斑狼疮(sLE)、64例类风湿关节炎(RA)和96名正常人血清中抗LcN蛋白多肽抗体，并分析该抗体与ss的临床及实验室指标的关系。结果抗LCN蛋白多肽抗体在原发性sS、继发性ss的阳性率分别为62%和54%.而在sLE、RA和正常人分别为21%、25%和3%;抗LcN蛋白多肽抗体在ss诊断的敏感性为61.2%.特异性为85.6%，阳性预测值62.7%，阴性预测值84.9%;原发性SS与继发性sS患者抗LcN蛋白多肽抗体阳性率的差异无统计学意义(P>0.05);ss患者抗LcN蛋白多肽抗体阳性率明显高于sLE、RA和正常人，差异有统计学意义(P0.05);抗LcN蛋白多肽抗体与ss患者临床表现、其他自身抗体无明显相关。结论①LcN蛋白可能是ss的一种自身抗原。②LcN蛋白多肽抗体对SS诊断具有参考价值。
【关键词】干燥综合征;疏水配体结合蛋白;酶联免疫吸附法；干燥综合症
干燥综合征(ss)是一个主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病，临床上尚无理想的血清学诊断方法。Navone等[’]应用重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术(sEREX)筛查ss相关自身抗原，其序列结果用BLAST软件与Gen’Bartk的已知基因进行对比分析，发现疏水配体结合蛋白(1ipocalin，LcN)可能是ss的自身抗原。为了解该蛋白在ss的临床意义，我们以LcN蛋白第148～169位氨基酸序列人工合成一条12肽片段 ，建立酶联免疫吸附(EusA)试验检测法，以了解LcN蛋白多肽抗体在ss诊断中的意义。
1资料和方法
1.1临床资料
1.1.1 sS患者：根据患者口、眼干燥的主观和(或)客观依据、唇腺活检及血清中出现抗核抗体、抗SSA/SSB抗体等，所有患者均符合2002年修订的ss
分类标准[引。85例ss均为2002年7月至2006年9月北京大学人民医院住院患者，男性4例，女性例，其中原发性SS 72例，继发于系统性红斑狼疮(SLE)的SS 4例，继发于类风湿关节炎(RA)者9例。年龄32～64岁，平均(53±8)岁，病程2.1～111.8年，平均(9±6)年。
1.1.2其他风湿性疾病组：包括SLE患者56例，年龄18～41岁，平均(30±6)岁，病程0.4～10.1年，平均(7±4)年;RA患者64例，年龄32～65岁，平均(5l±8)岁，病程1.1～13.5年，平均(8±5)年。以上病例均来自2()04—2006年北京大学人民医院住院患者，符合各自的美国风湿病学院(ACR)分类标准。
1.1_3正常对照组：96名，男性57名，女性39名，年龄21～39岁，平均(33±5)岁，均来自健康献血者。
1.2研究方法
1.2.1 LcN蛋白多肽抗原合成：选择LcN蛋白第148～169位氨基酸序列，由赛百盛生物公司(北京)
采用固相法人工合成一条含12个氨基酸残基的线性肽段FEKAAGARGL ，纯度>90%。
1-2-2 EL[SA法检测LcN蛋白多肽抗体：以10mg/L的LCN蛋白多肽包被96孔酶标板，4℃孵育过夜，
以含0.05%~吐-温的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，加人5cA脱脂奶粉100¨1封闭4 h。 血 清标本用PBS稀释100倍后加样，37℃孵育1 h。洗板3次后加入PBS 1：5000稀释的辣根过氧化酶标记的山羊抗人IgG(北京中衫金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1 h。洗板后加邻苯二胺(0PD)显色剂显色20 min，2.5 mol/I.硫酸终止反应，在450 nm波长下读取吸光度(A)值。每板同时设空白对照、阳性对照、阴性对照，待测标本A值>正常标本X±2为阳性阈值。
1.2.3抗SSA 52 000抗体、抗SSB抗体：以免疫印迹法检测，采用德国欧盟公司诊断试剂盒。抗a一胞衬蛋白抗体以EL[SA法检测，采用德国AESKu公司诊断试剂盒。
1.3统计学处理
计算抗LCN蛋白多肽抗体在ss的敏感性和特异性。两组结果的相关性通过 检验或两独立样本非参数检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2结 果
2.1抗LcN蛋白多肽抗体在不同疾病的阳性率：LCN蛋白多肽抗体在ss的敏感性为61.2%，特异性为85.6%，阳性预测值62.7%，阴性预测值84.9vA，。SS患者抗LcN蛋白多肽抗体阳性率明显高于sLE、RA和正常人，差异有统计学意义。
2。2抗LCN蛋白多肽抗体在各组的滴度水平：正常人血清LcN蛋白多肽抗体阳性阈值A=0.941。LcN蛋白多肽抗体在ss的滴度明显高于sLE、RA和正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。3名正常人血清与LcN蛋白多肽反应，但其4值仅略高于阳性域值。
2。3抗LcN蛋白多肽抗体对血清阴性原发性Ss患者的意义：在抗SSA 52 000抗体、抗SSB抗体、抗a一胞衬蛋白抗体阴性的原发性ss患者的血清中可以检测到抗LcN蛋白多肽抗体(表2)。说明抗LcN蛋白多肽抗体的检测对抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗仅一胞衬蛋白抗体阴性的原发性SS患者的诊断具有一定意义。
2-4抗LCN蛋白多肽抗体与原发性SS患者脏器受累及其他实验室指标的相关性：抗LCN蛋白多肽抗体阳性的原发性SS患者重要脏器受累包括肺间质纤维化、血管炎、肾功能不全、肝功能损害的发生率均高于阴性组，口干、眼干发生率亦高于阴性组，两组问的差异尚无统计学意义(尸>0.05)。抗LcN蛋白多肽抗体阳性组抗核抗体、类风湿因子的阳性率及IgG升高发生率高于阴性组，而红细胞沉降率(ESR)、[gA和IgM升高发生率低于阴性组，两组问差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。抗LCN蛋白多肽抗体阳性组病程与阴性组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
3讨 论
发现新的ss特异性自身抗体/靶抗原对提高ss诊断水平有重要意义。Navone：等[’]以原发性Ss患者混合血清IgG筛选FliTrex随机肽文库，得到一条新的sS相关自身抗原肽(ss肽)，其氨基酸序列为GDRDA(;SRGLVS.72.5%的SS患者血清中检测到该肽段抗体，而sLE、RA及正常人血清中该肽段抗体均为阴性。ss肽与人类蛋白资料库的已知病毒/自身抗原肽段氨基酸序列进行对比分析，发现EB病毒早期抗原蛋白D、a一胞衬蛋白和LcN蛋白核心肽与ss肽有同一性，3种蛋白与抗ss肽抗体均有交叉反应。进一步检测10例原发性ss患者_l『u.清，9例存在抗LcN蛋白抗体。据此作者提出LcN蛋白可能是新发现的Ss自身抗原。本研究以合成的LCN蛋白核心多肽为抗原检测sS 血清，结果61.2vA，患者检测到抗LcN蛋白多肽抗体，特异性为85.6vA，，提示ss患者血清中存在抗LcN蛋白抗体，支持LcN蛋白可能是ss自身抗原的推断。高滴度抗LCN蛋白抗体主要见于原发性和继发性ss患者，本研究中1例SLE和2例RA患者血清出现较高滴度抗LcN蛋白多肽抗体。高滴度抗LcN蛋白多肽抗体是否预示这些患者继发干燥综合征，尚待进一步观察。
LcN蛋白是亲脂基团载体蛋白超家族的一个成员，主要在泪腺和舌von E})Flel~-腺合成的分泌蛋白，近年发现鼻黏膜、气管和前列腺也有表达川。ss患者如何失去对LcN蛋白的免疫耐受尚无研究。根据目前对SS等自身免疫病自身抗原的形成及发病机制的认识，推测LCN蛋白可能是在ss发病过程中，通过下列机制获得免疫原性：①LcN蛋白肽与EB病毒早期抗原蛋白D和a一胞衬蛋白肽有同一性，SS血清IgG交叉识别上述3种蛋白 ，ss的免疫系统通过分子模拟机制产生抗LcN蛋白抗体。②ss腺体上皮细胞凋亡过程中，多种sS自身抗原包括源于细胞骨架的a一和B一胞衬蛋白、La/SSB、Ku等细胞内蛋白被casp ases酶裂解，降解片段发生蛋白重构，隐匿的抗原决定簇显露，从而获得抗原性 。③凋亡腺体细胞潜在的自身抗原重新分布：抗52 000 SSA抗体浓聚在细胞膜泡或胞核凋亡小体中，抗60 000SSA抗体、SSB抗体及Ku等核抗原聚集在固缩染色体边沿，抗原的重新定位使局部浓度超过阈值，易于被抗原递呈细胞识别和捕获. ④在ss腺体组织炎症微环境/凋亡细胞内，LCN蛋白通过磷酸化或瓜氨酸化等途径发生蛋白的翻译后修饰，转变成自身抗原%同时炎症组织B细胞刺激因子等细胞因子增多，促进体液免疫对潜在自身抗原的反应性…]。但目前尚不清楚LcN蛋白是否casf)ases酶的底物，对凋亡腺体中LcN蛋白的代谢途径也缺乏了解。
LCN蛋白占泪液蛋白的150A，～33vA，，是泪液主要的脂结合蛋白，起润滑眼睑，清除亲脂性有害物质，抑制致病微生物生长，参与体内抗氧化等作用，是上皮细胞重要的保护因子和泪膜稳定因子。抗LcN蛋白抗体可能通过结合LcN蛋白，中和其功能起致病作用：①泪膜稳定性降低，泪液蒸发、流失增多，易于形成干眼症。②泪膜防御功能被削弱，泪腺病毒感染和病毒再激活的机会增多，相应增加了感染启动的腺体组织的炎症反应。Redl等13发现LcN蛋白抗血清能与人唾液、泪液及鼻黏液蛋白发生反应，提示抗LCN蛋白抗体亦可能通过抗体介导的炎症反应损伤靶器官。
综上所述，LCN蛋白可能是Ss相关自身抗原。抗LcN蛋白多肽抗体在ss有较高的敏感性和特异性.可能是一种新的诊断ss的抗体，对于抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗a一胞衬蛋白抗体阴性的SS患者的诊断具有重要意义。以合成的多肽为抗原，EL[SA法检测，方法简单易行，便于临床应用。 （注：干燥综合症病人或亲属可加QQ群交流，群号： 118194945 ，本网站站长私人微信号： ssgzz88 ）
【关键词】干燥综合征;疏水配体结合蛋白;酶联免疫吸附法；干燥综合症
干燥综合征(ss)是一个主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病，临床上尚无理想的血清学诊断方法。Navone等[’]应用重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术(sEREX)筛查ss相关自身抗原，其序列结果用BLAST软件与Gen’Bartk的已知基因进行对比分析，发现疏水配体结合蛋白(1ipocalin，LcN)可能是ss的自身抗原。为了解该蛋白在ss的临床意义，我们以LcN蛋白第148～169位氨基酸序列人工合成一条12肽片段 ，建立酶联免疫吸附(EusA)试验检测法，以了解LcN蛋白多肽抗体在ss诊断中的意义。
1资料和方法
1.1临床资料
1.1.1 sS患者：根据患者口、眼干燥的主观和(或)客观依据、唇腺活检及血清中出现抗核抗体、抗SSA/SSB抗体等，所有患者均符合2002年修订的ss
分类标准[引。85例ss均为2002年7月至2006年9月北京大学人民医院住院患者，男性4例，女性例，其中原发性SS 72例，继发于系统性红斑狼疮(SLE)的SS 4例，继发于类风湿关节炎(RA)者9例。年龄32～64岁，平均(53±8)岁，病程2.1～111.8年，平均(9±6)年。
1.1.2其他风湿性疾病组：包括SLE患者56例，年龄18～41岁，平均(30±6)岁，病程0.4～10.1年，平均(7±4)年;RA患者64例，年龄32～65岁，平均(5l±8)岁，病程1.1～13.5年，平均(8±5)年。以上病例均来自2()04—2006年北京大学人民医院住院患者，符合各自的美国风湿病学院(ACR)分类标准。
1.1_3正常对照组：96名，男性57名，女性39名，年龄21～39岁，平均(33±5)岁，均来自健康献血者。
1.2研究方法
1.2.1 LcN蛋白多肽抗原合成：选择LcN蛋白第148～169位氨基酸序列，由赛百盛生物公司(北京)
采用固相法人工合成一条含12个氨基酸残基的线性肽段FEKAAGARGL ，纯度>90%。
1-2-2 EL[SA法检测LcN蛋白多肽抗体：以10mg/L的LCN蛋白多肽包被96孔酶标板，4℃孵育过夜，
以含0.05%~吐-温的磷酸盐缓冲液(PBS)洗板3次，加人5cA脱脂奶粉100¨1封闭4 h。 血 清标本用PBS稀释100倍后加样，37℃孵育1 h。洗板3次后加入PBS 1：5000稀释的辣根过氧化酶标记的山羊抗人IgG(北京中衫金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1 h。洗板后加邻苯二胺(0PD)显色剂显色20 min，2.5 mol/I.硫酸终止反应，在450 nm波长下读取吸光度(A)值。每板同时设空白对照、阳性对照、阴性对照，待测标本A值>正常标本X±2为阳性阈值。
1.2.3抗SSA 52 000抗体、抗SSB抗体：以免疫印迹法检测，采用德国欧盟公司诊断试剂盒。抗a一胞衬蛋白抗体以EL[SA法检测，采用德国AESKu公司诊断试剂盒。
1.3统计学处理
计算抗LCN蛋白多肽抗体在ss的敏感性和特异性。两组结果的相关性通过 检验或两独立样本非参数检验进行比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2结 果
2.1抗LcN蛋白多肽抗体在不同疾病的阳性率：LCN蛋白多肽抗体在ss的敏感性为61.2%，特异性为85.6%，阳性预测值62.7%，阴性预测值84.9vA，。SS患者抗LcN蛋白多肽抗体阳性率明显高于sLE、RA和正常人，差异有统计学意义。
2。2抗LCN蛋白多肽抗体在各组的滴度水平：正常人血清LcN蛋白多肽抗体阳性阈值A=0.941。LcN蛋白多肽抗体在ss的滴度明显高于sLE、RA和正常对照组，差异有统计学意义(p<0.05)。3名正常人血清与LcN蛋白多肽反应，但其4值仅略高于阳性域值。
2。3抗LcN蛋白多肽抗体对血清阴性原发性Ss患者的意义：在抗SSA 52 000抗体、抗SSB抗体、抗a一胞衬蛋白抗体阴性的原发性ss患者的血清中可以检测到抗LcN蛋白多肽抗体(表2)。说明抗LcN蛋白多肽抗体的检测对抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗仅一胞衬蛋白抗体阴性的原发性SS患者的诊断具有一定意义。
2-4抗LCN蛋白多肽抗体与原发性SS患者脏器受累及其他实验室指标的相关性：抗LCN蛋白多肽抗体阳性的原发性SS患者重要脏器受累包括肺间质纤维化、血管炎、肾功能不全、肝功能损害的发生率均高于阴性组，口干、眼干发生率亦高于阴性组，两组问的差异尚无统计学意义(尸>0.05)。抗LcN蛋白多肽抗体阳性组抗核抗体、类风湿因子的阳性率及IgG升高发生率高于阴性组，而红细胞沉降率(ESR)、[gA和IgM升高发生率低于阴性组，两组问差异均无统计学意义(P>0.05)(表3)。抗LCN蛋白多肽抗体阳性组病程与阴性组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
3讨 论
发现新的ss特异性自身抗体/靶抗原对提高ss诊断水平有重要意义。Navone：等[’]以原发性Ss患者混合血清IgG筛选FliTrex随机肽文库，得到一条新的sS相关自身抗原肽(ss肽)，其氨基酸序列为GDRDA(;SRGLVS.72.5%的SS患者血清中检测到该肽段抗体，而sLE、RA及正常人血清中该肽段抗体均为阴性。ss肽与人类蛋白资料库的已知病毒/自身抗原肽段氨基酸序列进行对比分析，发现EB病毒早期抗原蛋白D、a一胞衬蛋白和LcN蛋白核心肽与ss肽有同一性，3种蛋白与抗ss肽抗体均有交叉反应。进一步检测10例原发性ss患者_l『u.清，9例存在抗LcN蛋白抗体。据此作者提出LcN蛋白可能是新发现的Ss自身抗原。本研究以合成的LCN蛋白核心多肽为抗原检测sS 血清，结果61.2vA，患者检测到抗LcN蛋白多肽抗体，特异性为85.6vA，，提示ss患者血清中存在抗LcN蛋白抗体，支持LcN蛋白可能是ss自身抗原的推断。高滴度抗LCN蛋白抗体主要见于原发性和继发性ss患者，本研究中1例SLE和2例RA患者血清出现较高滴度抗LcN蛋白多肽抗体。高滴度抗LcN蛋白多肽抗体是否预示这些患者继发干燥综合征，尚待进一步观察。
LcN蛋白是亲脂基团载体蛋白超家族的一个成员，主要在泪腺和舌von E})Flel~-腺合成的分泌蛋白，近年发现鼻黏膜、气管和前列腺也有表达川。ss患者如何失去对LcN蛋白的免疫耐受尚无研究。根据目前对SS等自身免疫病自身抗原的形成及发病机制的认识，推测LCN蛋白可能是在ss发病过程中，通过下列机制获得免疫原性：①LcN蛋白肽与EB病毒早期抗原蛋白D和a一胞衬蛋白肽有同一性，SS血清IgG交叉识别上述3种蛋白 ，ss的免疫系统通过分子模拟机制产生抗LcN蛋白抗体。②ss腺体上皮细胞凋亡过程中，多种sS自身抗原包括源于细胞骨架的a一和B一胞衬蛋白、La/SSB、Ku等细胞内蛋白被casp ases酶裂解，降解片段发生蛋白重构，隐匿的抗原决定簇显露，从而获得抗原性 。③凋亡腺体细胞潜在的自身抗原重新分布：抗52 000 SSA抗体浓聚在细胞膜泡或胞核凋亡小体中，抗60 000SSA抗体、SSB抗体及Ku等核抗原聚集在固缩染色体边沿，抗原的重新定位使局部浓度超过阈值，易于被抗原递呈细胞识别和捕获. ④在ss腺体组织炎症微环境/凋亡细胞内，LCN蛋白通过磷酸化或瓜氨酸化等途径发生蛋白的翻译后修饰，转变成自身抗原%同时炎症组织B细胞刺激因子等细胞因子增多，促进体液免疫对潜在自身抗原的反应性…]。但目前尚不清楚LcN蛋白是否casf)ases酶的底物，对凋亡腺体中LcN蛋白的代谢途径也缺乏了解。
LCN蛋白占泪液蛋白的150A，～33vA，，是泪液主要的脂结合蛋白，起润滑眼睑，清除亲脂性有害物质，抑制致病微生物生长，参与体内抗氧化等作用，是上皮细胞重要的保护因子和泪膜稳定因子。抗LcN蛋白抗体可能通过结合LcN蛋白，中和其功能起致病作用：①泪膜稳定性降低，泪液蒸发、流失增多，易于形成干眼症。②泪膜防御功能被削弱，泪腺病毒感染和病毒再激活的机会增多，相应增加了感染启动的腺体组织的炎症反应。Redl等13发现LcN蛋白抗血清能与人唾液、泪液及鼻黏液蛋白发生反应，提示抗LCN蛋白抗体亦可能通过抗体介导的炎症反应损伤靶器官。
综上所述，LCN蛋白可能是Ss相关自身抗原。抗LcN蛋白多肽抗体在ss有较高的敏感性和特异性.可能是一种新的诊断ss的抗体，对于抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗a一胞衬蛋白抗体阴性的SS患者的诊断具有重要意义。以合成的多肽为抗原，EL[SA法检测，方法简单易行，便于临床应用。 （注：干燥综合症病人或亲属可加QQ群交流，群号： 118194945 ，本网站站长私人微信号： ssgzz88 ）