淋巴细胞功能相关抗原一1在干燥综合症发病中的作用
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日期：2015-05-12
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【摘要】 目的探讨细胞问黏附分子(IcAM)一1和淋巴细胞功能相关抗原(LFA)一1在干燥综合征(ss)的发病机制中的作用。方法用免疫组织化学SABC法，3，3一二氨基联苯胺(DAB)显色，对32例不同程度干燥综合征患者唇腺组织和15名正常对照组进行T ICAM一1和LFA一1的检测。结果①ICAM一1和LFA一1在SS组的表达明显高于对照组(P<0.01 oICAM一1分布广泛，以导管上皮表达最强，其他腺上皮、血管内皮及淋巴细胞浸润区均有表达;LFA一1则主要表达于淋巴细胞浸润区。②ICAM一1及LFA一1在SSf『勺表达随着淋巴细胞浸润程度的加重呈递增趋势。③ICAM一1和LFA一1呈直线相关(，:0.989.P<0.01)。结论上皮细胞在SS中起非专职抗原提呈细胞作用，积极参与了诱导和维持淋巴细胞的浸润.
【关键词1干燥综合症;涎腺;细胞黏附分子;淋巴细胞功能相关抗原1干燥综合征(Sjgreil‘s syndrome，sS)是一种以外分泌腺受累为主要表现的自身免疫性疾病。唾液腺及泪腺大量炎性细胞浸润，使腺体的结构遭到破坏，以致功能减退或丧失。干燥综合征的发病机制至今尚未完全明了，目前对该病的研究主要从免疫学和分子生物学角度进行。近期在对自身免疫病的研究中黏附分子(cellular adhesi。n m。lecul。s.CAM)'~IJT很大关注。细胞间黏附分子(IcAM)～1和淋巴细胞功能相关抗原(LFA)一1是具有配受体关系的最重要的CAM，参与抗原识别及淋巴细胞的协同刺激。在免疫反应的发生及反应的过程中，细胞因子及CAM作为炎症的介质和Ⅱ类抗原的诱导物以及协同信号转导参与了自身免疫的全过程。既往大量研究表明，在类风湿关节炎(rheUlllaoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(sYstemic lupus erytheiT/atOSHS SLE) 自身免疫病中.ICAM一1和LFA一1的表达均增强…，而对SS的研究国内文献极少有SS中黏附分子的报道，国外文献有相关的研究也较少。本研究通过观察SS唇腺中ICAM一1和LFA一1表达，初步推测SS中ICAM—l和LFA一1在发病机制中的作用。
1资料和方法
1.1病例选择
选择2004年】月到2005年3月山西医科大学第二医院口腔科门诊、风湿免疫科就诊的未经治疗的SS 32例，均符合1992年SS欧洲诊断标准。32例患者中，男性5例.女性27例;年龄26～54岁，平均(40±10)岁;病程3～76个月.平均(25±l 1)个月。正常对照组为15例黏液腺囊肿手术患者.男性4例，女性11例;年龄19～34岁，平均(25±4)岁。采集病例组及对照组唇腺组织。
1.2‘方法
l·2·1试剂：ICAM一1一抗(兔抗人)购自武汉博士德生物工程有限公司，稀释度为1：100。LFA～1一抗(鼠抗人)购自北京邦定生物医学公司，为工作液。免疫学检测系统为武汉博士德生物工程有限公司即用型SABC试剂盒。
l·2·2检测方法：将新鲜唇腺组织常规lO%F醛固定，石蜡包埋。载玻片经多聚赖氨酸防脱处理后，切片机连续切片.厚度为5um。切片首先进行苏木素一伊红(HE)染色，按Chishohn等2的分级标准对标本进行病理分级。镜下淋巴浸润灶细胞个数至少50个为l灶，每4 aim2有1个灶为I级.浸润灶有2+/4 lilm.为Ⅱ级，浸润灶有3+/4 mm2为Ⅲ级.浸润灶有4个或以上/4 illmz为Ⅳ级。
免疫组织化学SABC法，严格按照试剂盒说明书进行，阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBs)代替一抗、二抗。根据免疫组织化学反应及3，3一二氨基联苯胺(DAB)显色试剂，光镜下棕黄色显色为阳性。利用图像分析软件按灰度分辨换算得出阳性单位(Pu)。细胞计数统计各部位100个细胞阳性表达数。
1.3统计学处理
在高倍镜下每片随机选取3个区域，在图像分析软件下进行统计，取平均值。结果分析采用SPSSIO.0软件正态分布.方差齐，则两组比较采用t检验，若数据符合正态分布但方差不齐，则进行￡’检验。多组间比较采用方差分析，组间两两比较仃SNK—q检验。P<0.05为差异有统计学意义。两个变量的关系采用直线回归与相关分析。
2结 果
2·l ICAM一1、LFA一1在干燥综合征唇腺的表达：32例患者均有ICAM一1、LFA一1表达，与正常组相比差异有统计学意义(P<0·01)，见表1。ICAM～1主要表达于导管上皮和腺上皮细胞.血管内皮表达比例也较高，淋巴细胞也有表达。LFA一1则丰要表达于淋巴细胞浸润区，其他部位很少表达，见表2，3。
2.2 ICAM一1、LFA一1在不同等级SS的表达：按照Chisho1m的分级标准，32例病例中I级9例，Ⅱ级11例，Ⅲ级7例.Ⅳ表2 ICAM一1在唇腺组织中不同部位的表达的阳性率(x±s)(%)表3 LFA—l在唇腺组织中不同部位的表达的阳性率(x±s)(%)级5例。IcAM一1，LFA一1总体上随着病情的加重二者表达呈增强趋势。IcAM一1、LFA一1在Ⅳ级与I、Ⅱ、Ⅲ级之间差异均有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ级与I级差异有统计学意义(P<0.05)：Ⅱ级与I级之间差异有统计学意义(P<0.05);在Ⅱ级和Ⅲ级之间差异无统计学意义(尸>0.05)。见表4。
表4 IcAM一1【。FA—l在不同等级ss的表达(;±s)
注：tt与I级相比P<0.05;“与Ⅱ级相比P<0.05;。与Ⅲ级相比P(O.05
2-3 IcAM一1、LFA一1的相关性分析：二者呈线性正相关(r=O.989，P
图1 ICAM—l LFA一1的散点图
3讨 论
SS的重要病理表现是大量的淋巴细胞灶性浸润，与其他自身免疫病相比，ss以侵犯腺体组织为特征，是局部免疫反应活跃的重要表现。cAM特别是IcAM一1、LFA一1被认为在炎症的介导和免疫应答淋巴细胞归巢起到了非常重要的作用。
3.1 ss的发病同腺体的上皮细胞承担了非专职的抗原提呈细胞功能有关：本研究发现IcAM一1病例组阳性表达高于对照组(pu上皮细胞4，还有资料认为IcAM一1只表达于血管内皮细胞，有待进一步调查。本研究中各部位均有表达，而上皮表达较其他稍多，而本组数据中不同级别阳性表达总的趋势为随着病情的加重表达增强，提示上皮细胞在ss发病机制中有着重要的意义.可能与上皮细胞承担了非专职的抗原提呈细胞功能有关。
正常情况下，唾液腺上皮细胞不表达人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类分子及IcAM一1等，当受到炎性细胞因子白细胞介素(IL)一2、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)一 等刺激诱导.使腺上皮细胞HLAⅡ类分子和黏附分子表达显著提高。’rsuna~rakis等[6]在实验中用IFN一^y、TNF一 诱导腺上皮细胞，均能导致同种基因淋巴细胞的增殖。李小春和l甘晓丹疫组织化学法检测到sS唾液腺IL一1、IL一6及tn—a，国外资料也报道多种细胞因子在ss的表达 。】。推测南于非特异性感染导致腺体组织中细胞因子的产生，II.一1、TNF一a、IFN一y等在发挥免疫效应的同时，诱导上皮细胞表达HLAⅡ类分子及】cAM一1.使其转化成为非专职抗原提呈细胞，IcAM一1作为第二信号协同其表面的HLAⅡ类分子向T淋巴细胞捉呈了自身抗原而激活了T淋巴细胞，成为效应细胞和记忆细胞，而淋巴细胞在增殖的同时分泌更多细胞因子，更多诱导上皮细胞表达HLAⅡ类分子及IcAM—l，更多诱使淋巴细胞归巢活化，使得病情加重。3-2 IcAM一1/LFA一1之间的相互作用是其在发病机制巾的关键：在对同一标本检测中发现ICAM一1与T.FA一1呈线性关.在高度聚集的淋巴细胞中高度表达LFA—l，且与IcAM一1相一致，说明了黏附分子的归巢作用使淋巴细胞定向移动，文献『10]报道淋巴细胞浸润区的T细胞是由循环中的细胞迁移而致，并非主要由局部淋巴细胞增殖而来。Anderson和Siahaan…：发现IcAM一1与LFA一1之问的相 互作用对于激活T细胞和细胞定向移动同等重要。冈此，阻断IcAM一1/LFA一1之间相互作用能够抑制T细胞活化，为治疗自身免疫和器官移植中提供一个可行的方法。Havashi等用抗IcAM一1与抗LFA一1抗体注射给MRLJlpr小鼠能够阻止舍格林综合征发展成为严重的联合免疫缺陷病。takahashi等lj也用抗IcAM一1与抗LFA一1抗体治疗NFS/sld小鼠阻止其疴隋的发展，由此可见，针对IcAM一1/IJFA一1的抗体能够作为一种治疗手段应用于自身免疫病。由于条件所限，数据样本量偏少，条件容许时需增大样本量进一步研究。 （注：干燥综合症病人或亲属可加QQ群交流，群号： 118194945 ，本网站站长私人微信号： ssgzz88 ）
【关键词1干燥综合症;涎腺;细胞黏附分子;淋巴细胞功能相关抗原1干燥综合征(Sjgreil‘s syndrome，sS)是一种以外分泌腺受累为主要表现的自身免疫性疾病。唾液腺及泪腺大量炎性细胞浸润，使腺体的结构遭到破坏，以致功能减退或丧失。干燥综合征的发病机制至今尚未完全明了，目前对该病的研究主要从免疫学和分子生物学角度进行。近期在对自身免疫病的研究中黏附分子(cellular adhesi。n m。lecul。s.CAM)'~IJT很大关注。细胞间黏附分子(IcAM)～1和淋巴细胞功能相关抗原(LFA)一1是具有配受体关系的最重要的CAM，参与抗原识别及淋巴细胞的协同刺激。在免疫反应的发生及反应的过程中，细胞因子及CAM作为炎症的介质和Ⅱ类抗原的诱导物以及协同信号转导参与了自身免疫的全过程。既往大量研究表明，在类风湿关节炎(rheUlllaoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮(sYstemic lupus erytheiT/atOSHS SLE) 自身免疫病中.ICAM一1和LFA一1的表达均增强…，而对SS的研究国内文献极少有SS中黏附分子的报道，国外文献有相关的研究也较少。本研究通过观察SS唇腺中ICAM一1和LFA一1表达，初步推测SS中ICAM—l和LFA一1在发病机制中的作用。
1资料和方法
1.1病例选择
选择2004年】月到2005年3月山西医科大学第二医院口腔科门诊、风湿免疫科就诊的未经治疗的SS 32例，均符合1992年SS欧洲诊断标准。32例患者中，男性5例.女性27例;年龄26～54岁，平均(40±10)岁;病程3～76个月.平均(25±l 1)个月。正常对照组为15例黏液腺囊肿手术患者.男性4例，女性11例;年龄19～34岁，平均(25±4)岁。采集病例组及对照组唇腺组织。
1.2‘方法
l·2·1试剂：ICAM一1一抗(兔抗人)购自武汉博士德生物工程有限公司，稀释度为1：100。LFA～1一抗(鼠抗人)购自北京邦定生物医学公司，为工作液。免疫学检测系统为武汉博士德生物工程有限公司即用型SABC试剂盒。
l·2·2检测方法：将新鲜唇腺组织常规lO%F醛固定，石蜡包埋。载玻片经多聚赖氨酸防脱处理后，切片机连续切片.厚度为5um。切片首先进行苏木素一伊红(HE)染色，按Chishohn等2的分级标准对标本进行病理分级。镜下淋巴浸润灶细胞个数至少50个为l灶，每4 aim2有1个灶为I级.浸润灶有2+/4 lilm.为Ⅱ级，浸润灶有3+/4 mm2为Ⅲ级.浸润灶有4个或以上/4 illmz为Ⅳ级。
免疫组织化学SABC法，严格按照试剂盒说明书进行，阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBs)代替一抗、二抗。根据免疫组织化学反应及3，3一二氨基联苯胺(DAB)显色试剂，光镜下棕黄色显色为阳性。利用图像分析软件按灰度分辨换算得出阳性单位(Pu)。细胞计数统计各部位100个细胞阳性表达数。
1.3统计学处理
在高倍镜下每片随机选取3个区域，在图像分析软件下进行统计，取平均值。结果分析采用SPSSIO.0软件正态分布.方差齐，则两组比较采用t检验，若数据符合正态分布但方差不齐，则进行￡’检验。多组间比较采用方差分析，组间两两比较仃SNK—q检验。P<0.05为差异有统计学意义。两个变量的关系采用直线回归与相关分析。
2结 果
2·l ICAM一1、LFA一1在干燥综合征唇腺的表达：32例患者均有ICAM一1、LFA一1表达，与正常组相比差异有统计学意义(P<0·01)，见表1。ICAM～1主要表达于导管上皮和腺上皮细胞.血管内皮表达比例也较高，淋巴细胞也有表达。LFA一1则丰要表达于淋巴细胞浸润区，其他部位很少表达，见表2，3。
2.2 ICAM一1、LFA一1在不同等级SS的表达：按照Chisho1m的分级标准，32例病例中I级9例，Ⅱ级11例，Ⅲ级7例.Ⅳ表2 ICAM一1在唇腺组织中不同部位的表达的阳性率(x±s)(%)表3 LFA—l在唇腺组织中不同部位的表达的阳性率(x±s)(%)级5例。IcAM一1，LFA一1总体上随着病情的加重二者表达呈增强趋势。IcAM一1、LFA一1在Ⅳ级与I、Ⅱ、Ⅲ级之间差异均有统计学意义(P<0.05)，Ⅲ级与I级差异有统计学意义(P<0.05)：Ⅱ级与I级之间差异有统计学意义(P<0.05);在Ⅱ级和Ⅲ级之间差异无统计学意义(尸>0.05)。见表4。
表4 IcAM一1【。FA—l在不同等级ss的表达(;±s)
注：tt与I级相比P<0.05;“与Ⅱ级相比P<0.05;。与Ⅲ级相比P(O.05
2-3 IcAM一1、LFA一1的相关性分析：二者呈线性正相关(r=O.989，P
图1 ICAM—l LFA一1的散点图
3讨 论
SS的重要病理表现是大量的淋巴细胞灶性浸润，与其他自身免疫病相比，ss以侵犯腺体组织为特征，是局部免疫反应活跃的重要表现。cAM特别是IcAM一1、LFA一1被认为在炎症的介导和免疫应答淋巴细胞归巢起到了非常重要的作用。
3.1 ss的发病同腺体的上皮细胞承担了非专职的抗原提呈细胞功能有关：本研究发现IcAM一1病例组阳性表达高于对照组(pu上皮细胞4，还有资料认为IcAM一1只表达于血管内皮细胞，有待进一步调查。本研究中各部位均有表达，而上皮表达较其他稍多，而本组数据中不同级别阳性表达总的趋势为随着病情的加重表达增强，提示上皮细胞在ss发病机制中有着重要的意义.可能与上皮细胞承担了非专职的抗原提呈细胞功能有关。
正常情况下，唾液腺上皮细胞不表达人类白细胞抗原(HLA)Ⅱ类分子及IcAM一1等，当受到炎性细胞因子白细胞介素(IL)一2、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)一 等刺激诱导.使腺上皮细胞HLAⅡ类分子和黏附分子表达显著提高。’rsuna~rakis等[6]在实验中用IFN一^y、TNF一 诱导腺上皮细胞，均能导致同种基因淋巴细胞的增殖。李小春和l甘晓丹疫组织化学法检测到sS唾液腺IL一1、IL一6及tn—a，国外资料也报道多种细胞因子在ss的表达 。】。推测南于非特异性感染导致腺体组织中细胞因子的产生，II.一1、TNF一a、IFN一y等在发挥免疫效应的同时，诱导上皮细胞表达HLAⅡ类分子及】cAM一1.使其转化成为非专职抗原提呈细胞，IcAM一1作为第二信号协同其表面的HLAⅡ类分子向T淋巴细胞捉呈了自身抗原而激活了T淋巴细胞，成为效应细胞和记忆细胞，而淋巴细胞在增殖的同时分泌更多细胞因子，更多诱导上皮细胞表达HLAⅡ类分子及IcAM—l，更多诱使淋巴细胞归巢活化，使得病情加重。3-2 IcAM一1/LFA一1之间的相互作用是其在发病机制巾的关键：在对同一标本检测中发现ICAM一1与T.FA一1呈线性关.在高度聚集的淋巴细胞中高度表达LFA—l，且与IcAM一1相一致，说明了黏附分子的归巢作用使淋巴细胞定向移动，文献『10]报道淋巴细胞浸润区的T细胞是由循环中的细胞迁移而致，并非主要由局部淋巴细胞增殖而来。Anderson和Siahaan…：发现IcAM一1与LFA一1之问的相 互作用对于激活T细胞和细胞定向移动同等重要。冈此，阻断IcAM一1/LFA一1之间相互作用能够抑制T细胞活化，为治疗自身免疫和器官移植中提供一个可行的方法。Havashi等用抗IcAM一1与抗LFA一1抗体注射给MRLJlpr小鼠能够阻止舍格林综合征发展成为严重的联合免疫缺陷病。takahashi等lj也用抗IcAM一1与抗LFA一1抗体治疗NFS/sld小鼠阻止其疴隋的发展，由此可见，针对IcAM一1/IJFA一1的抗体能够作为一种治疗手段应用于自身免疫病。由于条件所限，数据样本量偏少，条件容许时需增大样本量进一步研究。 （注：干燥综合症病人或亲属可加QQ群交流，群号： 118194945 ，本网站站长私人微信号： ssgzz88 ）