抗毒蕈碱受体3多肽抗体测定在干燥综合征诊断中意义
发表者：方万何 菁姚中 粟占国
日期：2015-04-21
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【摘要】 目的建立酶联免疫吸附试验(ELISA)~检测抗毒蕈碱3受体多肽(M，RP)~/L体的方法，探讨该抗体在干燥综合征(ss)诊断中的意义。方法 以固相合成的多肽M，RP为包被抗原，ELISA定量检测94例干燥综合征，160例其他结缔组织病及200名正常人血清中的抗M，RP抗体水平，并分析其与SS临床表现的相关性。结果抗M，RP抗体在原发干燥综合征(pss)、继发干燥综合征(sss)患者中阳性率分别为84.6%~11 81-3%，在其他结缔组织病和正常对照组中的阳性率分别为8.8%和1%。M，RP抗体在SS患者中阳性率显著高于其他结缔组织病患者及正常对照组(尸<0.01 o而且，M，RP抗体在pSS和sSS中f削寺异性均为91.3%。pSS患者与。SS患者抗M，RP抗体阳性率差异无统计学意义。抗M，RP抗体与SS患者临床表现和脏器受累情况无明显相关性。该抗体在抗仪一胞衬蛋白、抗SSA、抗SSB和抗核抗体阴性的SS患者中抗M，RP抗体的阳性率分别为85%、89.3%、88.9%1：31 95.2%。在pSS中，抗M，RP抗体阳性的患者血清中IgG水平明显高于抗体阴性的患者。结论①ELISA法可检测pss和sSS患者『皿清中的抗M，RP抗体，该抗体为诊断SS的较为特异的自身抗体之一。②抗M，RP抗体对其他自身抗体阴性的ss诊断有参考意义。
【关键词】干燥综合征;毒蕈碱3受体;M，受体多肽
干燥综合征(Si6gren’s syndrome，SS)是一种累及全身外分泌腺的慢性炎症性自身免疫病，主要侵犯泪腺和唾液腺，表现为眼和口腔干燥，并可有肺、肾等内脏受累。在欧美人群中本病的患病率为O.5%～5%，在我国的患病率为0.77%，在老年人中可高达3%～4%11]。
目前在临床上尚未发现ss较为理想的血清学诊断方法。抗SSA、抗SSB、抗0/.一胞衬蛋白抗体与ss的发病密切相关，但这些抗体在ss患者血清中特异性及敏感性并不十分理想I刈。文献f5—7]报道在SS动物模型——非肥胖型糖尿病小鼠(NOD鼠)及Ss患者血清中，可以检测到抗M，受体抗体，并进一步指出该抗体与SS的发病有关。蛋白结构分析以及血清学的检测揭示位于胞外第2环的213—228区段的16个氨基酸多肽具有明显的抗原性，在原发性干燥综合征(pSS)患者中抗M，受体多肽(M，RP)抗体的阳性率达到了90%l 8'9】。近几年来，对M，受体以及抗M，受体抗体和sS关系的研究有了一些进展，但是至今为止还没有关于该抗体的大样本的临床研究。本研究的目的是建立一种临床适用的M，RP抗体的检测方法，以进一步了解抗M，RP抗体在诊断ss及其他结缔组织病中的敏感性和特异性，并分析其与临床表现的相关性。
1、资料与方法
1.1临床资料：①ss患者：选取2002—2006年在北京大学人民医院风湿免疫科住院的SS患者94例，均符合2002年修订的欧美ss分类标准l】【)l，其中pSS 78例，继发性干燥综合征(sSS)16例;女性78例，男性16例，年龄34.72岁，平均(50+15)岁，病程1～13年，平均(6+4)年。②其他结缔组织病患者：类风湿关节炎(RA)80例，其中女性53例，男性27例，年龄41～67岁，平均(45±4)岁，病程3～8年，平均(4.2±1.1)年;系统性红斑狼疮(sLE)80例，其中女性73例，男性7例，年龄21～55岁.平均(26±5)岁，病程1—9年，平均(3±1)年，以上病例全部来自2002—2006年北京大学人民医院住院患者’，诊断均符合各自的国际或美国风湿病学会修订的分类标准。③正常对照组200名，均来自本院健康献血者。J.2研究方法?利用固相合成的M;受体胞外第2环上的一段16个氨基酸的多肽(KRTvPP(迎C—F。[QF、LSE)作为抗原包板，然后酶联免疫吸附试验定量测定抗M，RP抗体，多肽溶于0.1 naol/[.DH 9.6的Na：HC0，溶液中，浓度为1 mg/ml，costar的酶标板每孔添加100¨l溶液，4 cC过夜包被。血清标本用磷酸盐缓冲液(PBsl稀释200倍，在已经包被了M，RP的96孔板上加样，每板同时设置空白对照、阴性对照、阳性对照，37℃孵育1 h，洗板3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗，37℃孵育1 h，洗板3次后加入四甲基联苯胺(TMB)底物37℃显色15rai‘n，加入终止液。在吸光度值(A)450 nm，校对A 630 nm处测定吸光度值。同样的检测程序用于检测血清中的抗M，RP的IgA和IgM抗体。
所有标本的抗SSA、SSB抗体均使用欧蒙公司的ENA试剂盒，以斑点法检测;d一胞衬蛋白IgC抗体用.Aesku公司的试剂盒，以酶联免疫吸附试验检测;ANA的检测使用欧蒙公司的间接免疫荧光法试剂盒。
1-3统计学处理：测定值为非正态分布，以大量的正常人血清样本的测定值的百分位数法单侧99%来确定截止(cut一0ff)值。在此基础上计算抗M，RP抗体在ss和其他结缔组织病中的敏感性和特异性。两组结果的相关性通过矿检验或两独立样本￡检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结 果
2.1抗M，RP—IgG抗体在SS和其他结缔组织病中的敏感性和特异性：试验组共计254.例，其中M扭P—IgG抗体敏感性和特异性在pSS患者和sss患者中分别为84.6%，91.3%和81.3%，91.3%，差异无统计学意义(P>0.05);在RA和sLE中抗M，RP—IgG抗体敏感性和特异性分别为10.0%，48.9%和7.5%，50.0%。结果显示该抗体在ss中的敏感性和特异性均明昂高于对照组(P<【1川).刃.表1.
2.2抗M，RP—kG抗体在不同疾病中的滴度比较：ELISA方法检测抗M，RP一.1eG抗体的A值在pSS、sSS、RA、sLE及正常对照组中的平均值分别为0.85、0.62、0.25、0.31、0.27。在ss患者组中抗体A值平均水平明显高于其他结缔组织病和正常人对照组。2-3 抗M，RP—IgG、I啦、IgM抗体3种亚型在ss中阳性率的比较：为了验证已合成的多肽抗原检测ss患者自身抗体的方法能否应用于区分不同亚型抗M，受体多肽自身抗体的检测，我们同时测定了33例pSS患者和7例sSS患者的抗M，RP—IgG、IgA和IgM抗体的水平(见表2)，在pSS和sSS中抗M，RP—IgG
抗体的阳性率均明显高于抗M，RP—In和抗M，RP—IgM的阳性率(P<0.01)。此外，在pSS患者中抗M，RP—IgG抗体阳性的患者IgG的平均水平为28.23g/L’明显高于阴性患者的11.25 g/L(尸<0.05)。
2.4抗M，RP抗体与其他自身抗体在ss检测中的阳性率的比较：抗M，RP抗体在pss患者中的敏感性为84.6%，明显高于抗仅一胞衬蛋白抗体抗SSA抗体、抗SSB抗体及抗核抗体(ANA)(。P<0.01)，见表3。此外在20例抗d一胞衬蛋白抗体阴性，28例抗体不仅是一个临床诊断标记，而且具有阻断M，受体的作用，抗M，受体抗体与SS的发病可能存在着密切的关系。此外，在抗仅一胞衬蛋白、抗SSA抗体、抗SSB抗体和ANA阴性的pSS患者中抗M，RP抗体的阳性率分别为850A，，89.3%，88.9%和95.2%。这些结果均表_日且了杭№即抗体是一令相对特异的自身抗体。而且，对于抗o【一胞衬蛋白、抗SSA抗体，抗SSB抗体和ANA阴性的pSS患者的诊断具有重要的意义。 （注：干燥综合症病人或亲属可加QQ群交流，群号： 118194945 ，本网站站长私人微信号： ssgzz88 ）
【关键词】干燥综合征;毒蕈碱3受体;M，受体多肽
干燥综合征(Si6gren’s syndrome，SS)是一种累及全身外分泌腺的慢性炎症性自身免疫病，主要侵犯泪腺和唾液腺，表现为眼和口腔干燥，并可有肺、肾等内脏受累。在欧美人群中本病的患病率为O.5%～5%，在我国的患病率为0.77%，在老年人中可高达3%～4%11]。
目前在临床上尚未发现ss较为理想的血清学诊断方法。抗SSA、抗SSB、抗0/.一胞衬蛋白抗体与ss的发病密切相关，但这些抗体在ss患者血清中特异性及敏感性并不十分理想I刈。文献f5—7]报道在SS动物模型——非肥胖型糖尿病小鼠(NOD鼠)及Ss患者血清中，可以检测到抗M，受体抗体，并进一步指出该抗体与SS的发病有关。蛋白结构分析以及血清学的检测揭示位于胞外第2环的213—228区段的16个氨基酸多肽具有明显的抗原性，在原发性干燥综合征(pSS)患者中抗M，受体多肽(M，RP)抗体的阳性率达到了90%l 8'9】。近几年来，对M，受体以及抗M，受体抗体和sS关系的研究有了一些进展，但是至今为止还没有关于该抗体的大样本的临床研究。本研究的目的是建立一种临床适用的M，RP抗体的检测方法，以进一步了解抗M，RP抗体在诊断ss及其他结缔组织病中的敏感性和特异性，并分析其与临床表现的相关性。
1、资料与方法
1.1临床资料：①ss患者：选取2002—2006年在北京大学人民医院风湿免疫科住院的SS患者94例，均符合2002年修订的欧美ss分类标准l】【)l，其中pSS 78例，继发性干燥综合征(sSS)16例;女性78例，男性16例，年龄34.72岁，平均(50+15)岁，病程1～13年，平均(6+4)年。②其他结缔组织病患者：类风湿关节炎(RA)80例，其中女性53例，男性27例，年龄41～67岁，平均(45±4)岁，病程3～8年，平均(4.2±1.1)年;系统性红斑狼疮(sLE)80例，其中女性73例，男性7例，年龄21～55岁.平均(26±5)岁，病程1—9年，平均(3±1)年，以上病例全部来自2002—2006年北京大学人民医院住院患者’，诊断均符合各自的国际或美国风湿病学会修订的分类标准。③正常对照组200名，均来自本院健康献血者。J.2研究方法?利用固相合成的M;受体胞外第2环上的一段16个氨基酸的多肽(KRTvPP(迎C—F。[QF、LSE)作为抗原包板，然后酶联免疫吸附试验定量测定抗M，RP抗体，多肽溶于0.1 naol/[.DH 9.6的Na：HC0，溶液中，浓度为1 mg/ml，costar的酶标板每孔添加100¨l溶液，4 cC过夜包被。血清标本用磷酸盐缓冲液(PBsl稀释200倍，在已经包被了M，RP的96孔板上加样，每板同时设置空白对照、阴性对照、阳性对照，37℃孵育1 h，洗板3次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG二抗，37℃孵育1 h，洗板3次后加入四甲基联苯胺(TMB)底物37℃显色15rai‘n，加入终止液。在吸光度值(A)450 nm，校对A 630 nm处测定吸光度值。同样的检测程序用于检测血清中的抗M，RP的IgA和IgM抗体。
所有标本的抗SSA、SSB抗体均使用欧蒙公司的ENA试剂盒，以斑点法检测;d一胞衬蛋白IgC抗体用.Aesku公司的试剂盒，以酶联免疫吸附试验检测;ANA的检测使用欧蒙公司的间接免疫荧光法试剂盒。
1-3统计学处理：测定值为非正态分布，以大量的正常人血清样本的测定值的百分位数法单侧99%来确定截止(cut一0ff)值。在此基础上计算抗M，RP抗体在ss和其他结缔组织病中的敏感性和特异性。两组结果的相关性通过矿检验或两独立样本￡检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结 果
2.1抗M，RP—IgG抗体在SS和其他结缔组织病中的敏感性和特异性：试验组共计254.例，其中M扭P—IgG抗体敏感性和特异性在pSS患者和sss患者中分别为84.6%，91.3%和81.3%，91.3%，差异无统计学意义(P>0.05);在RA和sLE中抗M，RP—IgG抗体敏感性和特异性分别为10.0%，48.9%和7.5%，50.0%。结果显示该抗体在ss中的敏感性和特异性均明昂高于对照组(P<【1川).刃.表1.
2.2抗M，RP—kG抗体在不同疾病中的滴度比较：ELISA方法检测抗M，RP一.1eG抗体的A值在pSS、sSS、RA、sLE及正常对照组中的平均值分别为0.85、0.62、0.25、0.31、0.27。在ss患者组中抗体A值平均水平明显高于其他结缔组织病和正常人对照组。2-3 抗M，RP—IgG、I啦、IgM抗体3种亚型在ss中阳性率的比较：为了验证已合成的多肽抗原检测ss患者自身抗体的方法能否应用于区分不同亚型抗M，受体多肽自身抗体的检测，我们同时测定了33例pSS患者和7例sSS患者的抗M，RP—IgG、IgA和IgM抗体的水平(见表2)，在pSS和sSS中抗M，RP—IgG
抗体的阳性率均明显高于抗M，RP—In和抗M，RP—IgM的阳性率(P<0.01)。此外，在pSS患者中抗M，RP—IgG抗体阳性的患者IgG的平均水平为28.23g/L’明显高于阴性患者的11.25 g/L(尸<0.05)。
2.4抗M，RP抗体与其他自身抗体在ss检测中的阳性率的比较：抗M，RP抗体在pss患者中的敏感性为84.6%，明显高于抗仅一胞衬蛋白抗体抗SSA抗体、抗SSB抗体及抗核抗体(ANA)(。P<0.01)，见表3。此外在20例抗d一胞衬蛋白抗体阴性，28例抗体不仅是一个临床诊断标记，而且具有阻断M，受体的作用，抗M，受体抗体与SS的发病可能存在着密切的关系。此外，在抗仅一胞衬蛋白、抗SSA抗体、抗SSB抗体和ANA阴性的pSS患者中抗M，RP抗体的阳性率分别为850A，，89.3%，88.9%和95.2%。这些结果均表_日且了杭№即抗体是一令相对特异的自身抗体。而且，对于抗o【一胞衬蛋白、抗SSA抗体，抗SSB抗体和ANA阴性的pSS患者的诊断具有重要的意义。 （注：干燥综合症病人或亲属可加QQ群交流，群号： 118194945 ，本网站站长私人微信号： ssgzz88 ）